Yliopistologo

FM Janne Toivosen molekyylibiologian alaan kuuluva väitöskirja

A Model for Mitochondrial Deafness in Flies. Expression and Mutation Analysis of Mitoribosomal Protein S12 (Mitokondriaalisen kuurouden mallintaminen banaanikärpäsellä. Mitoribosomaalisen proteiinin S12 ekspressio - ja mutaatioanalyysi)

tarkastetaan 25.10.2003 klo 12 Tampereen yliopiston Finn-Medi 1 auditoriossa, Lenkkeilijänkatu 6, Tampere.

Vastaväittäjänä on professori Laurie Kaguni (Michiganin yliopisto). Kustoksena toimii professori Howard Jacobs.

***

Janne Toivonen on syntynyt Jyväskylässä ja hän on suorittanut filosofian maisterin tutkinnon Jyväskylän yliopistossa. Hän on työskennellyt tutkijana Tampereen yliopiston Lääketieteellisen teknologian instituuttissa vuodesta 1998.

Toivosen väitöskirja ilmestyy sarjassa Acta Universitatis Tamperensis; 960, Tampereen yliopisto, Tampere 2003. ISBN 951-44-5781-1, ISSN 1455-1616. Ilmestyy myös sähköisenä sarjassa Acta Electronica Universitatis Tamperensis; 285, Tampereen yliopisto 2003.
ISBN 951-44-5782-X, ISSN 1456-954X, http://acta.uta.fi.

Väitöskirjan tilausosoite: Verkkokirjakauppa Granum, http://granum.uta.fi, tai Tampereen yliopiston julkaisujen myynti, PL 617, 33101 Tampere, puh. (03) 215 6055, e-mail: taju@uta.fi.

Lisätietoja: Janne Toivonen, 0400 538 626 (koti), (03) 215 7734 (työ), janne.m.toivonen@uta.fi

LEHDISTÖTIEDOTE

Mitokondriot ovat soluorganelleja, joissa tapahtuvat solun energiantuotannon keskeiset prosessit. Tämän ohella mitokondriot osallistuvat mm. solun kalsiumtasapainon sekä ohjelmoidun solukuoleman säätelyyn. Mitokondrion kalvostolla sijaitsevat hengitysketjun entsyymit tuottavat energiaa, joka vapautetaan solun käyttöön adenosiinitrisfosfaatin (ATP) muodossa. Mitokondrioilla on oma, useana kopioina esiintyvä rengasmainen genominsa (mtDNA), joka koodaa hengitysketjun entsyymien alayksikköjä sekä mitokondrioiden omaan proteiinisynteesiin tarvittavia siirtäjä-RNA - ja ribosomaalisia RNA-molekyylejä. mtDNA periytyy äidiltä ja vastaa noin 1% solun kokonais-DNA:sta. Hengitysketjun entsyymikompleksit koostuvat sekä tuman että mtDNA:n koodaamista alayksiköistä ja mutaatiot kummankin genomin tuotteissa saattavat johtaa mitokondrioiden periytyvään toimintahäiriöön.

Mitokondriotaudit käsittävät laajan kirjon kliinisesti ja geneettisesti monimuotoisia sairauksia. Saman oireiston voivat aiheuttaa eri geenivirheet ja toisaalta sama biokemiallinen häiriö saattaa johtaa erilaisiin taudinkuviin. Usein taudit ovat syndromisia eli useisiin kudoksiin vaikuttavia toimintahäiriöitä (esim. MELAS tai MERRF), kun taas toisinaan oireena on vain esim. sensorineuraalinen kuurous (sisäkorvan tai kuulohermon alueen vika). Myös geneettinen tausta ja ympäristön kautta saatavat kemikaalit, kuten antibiootit, saattavat vaikuttaa ilmiasun kehittymiseen. Tyypillisesti runsaasti energiaa vaativat kudokset, kuten lihakset ja keskushermosto, kärsivät herkimmin soluhengityksen vajaavaisuudesta, mutta tautien kudosspesifisyyttä ei tällä hetkellä ymmärretä riittävästi. mtDNA:n mutaatioiden kohdalla tautien tutkimusta vaikeuttaa lisäksi niiden erityislaatuinen periytyminen, sillä usein oireiden vakavuus määräytyy virheellisen ja normaalin mtDNA:n suhteellisesta määrästä (heteroplasmia) solussa tai kudoksessa. Vaikka soluviljelymallit ovat tuottaneet paljon arvokasta tietoa tautien perusmekanismeista, eläimalleja tarvitaan jotta voitaisiin selvittää näiden vaikutusta koko organismin tasolla, kuten esim. kudosspesifisyyttä. Usein eläimalleissa joudutaan turvautumaan tuman koodaamien mitokondriaalisten proteiinien manipulaatioihin, sillä tällä hetkellä kohdennettujen mutaatioiden luominen mtDNA:han ei ole mahdollista.

Väitöskirjatyössäni olen tutkinut banaanikärpäsen (Drosophila melanogaster) sopivuutta erityisesti sellaisten mitokondriaalisten tautien tutkimuksessa, jotka johtavat mitokondriaalisen proteiinisynteesin heikkenemiseen. Olen käyttänyt aikaisemmin kuvattua mutaatiota banaanikärpäsen tuman koodaamassa geenissä tko (technical knockout), jonka geenituote on mitokondriaalisen ribosomin evolutiivisesti säilynyt proteiini S12 (rps12). Mutaatio alleelissa tko(25t) aiheuttaa banaanikärpäsessä yliherkkyyden mekaaniselle stressille sekä johtaa käsittelyn jälkeiseen väliaikaiseen halvaantumiseen. Olen selvittänyt mutaation vaikutuksia proteiinitasolla mallintamalla sen toimintaa bakteerisoluissa sekä manipuloinut tko(25t) alleelin ilmentymistasoja tuottamissani siirtogeenisissä banaanikärpäslinjoissa. Olen myös tuottanut ja alustavasti analysoinut siirtogeenisiä linjoja, joiden avulla mitokondriaalisen proteiinisynteesin vajavaisuutta voidaan tulevaisuudessa tutkia kudosspesifisesti.

Keskeisiä löydöksiäni ovat, että tko(25t) mutaatio johtaa mitokondriaalisen proteiinisynteesin heikkenemiseen ja aiheuttaa banaanikärpäsellä oireita, jotka mimikoivat translaatioon liityvien mtDNA-mutaatioiden ilmiasuja ihmisillä. Sekä hengitysketjun entsyymien aktiivisuus että ATP:n tuotto ovat matalammat mutanteilla. tko(25t) -mutanttien kehityskaari kestää kauemmin verrattuna normaaleihin (villityypin) kärpäsiin ja ne ovat yliherkkiä doksisykliinille, joka on spesifinen mitokondriaalisen proteiinisynteesin estäjä. Käyttäytymiskokeiden perusteella näyttää myös siltä, että tko(25t) mutantit ovat kuuroja. Vaikka mutatoituneen tko(25t) alleelin ilmentämisen lisääminen siirtogeenisesti johtaakin osittaiseen biokemiallisten puutteiden korjaantumiseen, tämä ei merkittävästi paranna ilmiasun puutteita, kuten stressiherkyyttä tai yksilönkehityksen jälkeenjääneisyyttä. Tässä mielessä tko-malli muistuttaa ihmisen heteroplasmisiin mtDNA-mutaatioihin liittyviä biokemiallisia kynnysefektejä, joissa esim. ATP:n tuotto ei lineaarisesti korreloi hengitysketjun alayksiköiden maksimiaktiivisuuksien kanssa.

Alustavien tulosten mukaan villityypin tko-siirtogeenin minimaalinen ilmeneminen mutatoituneella geneettisellä taustalla johtaa tiettyjen ilmiasun muutoksien parantumiseen riippuen ilmentymisen yksilönkehitysasteesta tai kudostyypistä. Toisaalta villityypin rps12:n voimakas, ei-säädelty ilmentäminen johtaa kuolemaan ennen banaanikärpäsen kehityskaaren täyttymistä. Tämä osoittaa, että mitokondriaaliseen proteiinisynteesiin liittyvien geenien ilmentämisen tulee olla tarkasti säädelty prosessi.

Lisäksi olen tutkinut vastaavan ihmisen geenin ilmenemisen säätelyä soluviljelymallein. Ihmisen rps12 proteiini kulkeutuu mitokondrioihin ja on siellä yhteydessä sisäkalvoon. Sitä ilmennetään voimakkaasti kudoksissa, jotka ovat riippuvaisia hengitysketjun tuottamasta energiasta, kuten sydän- ja luurankolihaksissa. Geenin säätely on monimutkainen prosessi, joka tapahtuu sekä lähetti-RNA:n synteesin, RNA-silmikoinnin, että rps12-proteiinin tuotannon tasolla. Eräs lähetti-RNA muoto on aktiivisesti käännetty proteiineiksi vain solujen ollessa kasvuvaiheessa ja toisista lähetti-RNA muodoista löytyy säätelyelementtejä, joiden merkitys vaatii vielä tarkempaa selvitystä.

Helposti manipuloitavana ja nopeasti lisääntyvänä eläimallina banaanikärpänen näyttäisi siis olevan yksi hyvä vaihtoehto myös mitokondriotautien perusmekanismien tutkimiselle. Tulevaisuudessa tko -mallia käyttäen on mahdollista tutkia tarkemmin niitä kudoksia ja kehityksellisien vaiheita, jotka ovat rajoittavia mitokondriaalisen proteiinisynteesin toiminnan kannalta. Lisäksi työssä luotuja siirtogeenisiä kantoja voidaan käyttää ns. suppressori-hakuun. Suppressorit ovat geneettisiä muutoksia, jotka kompensoivat taudin ilmiasua, ja voisivat täten auttaa ymmärtämään syvemmin mitokondrioperäisten tautien, kuten kuurouden, patogeneesiä myös ihmisellä.


[laskuri] käyntiä 9.10.2003 alkaen

Väitökset    Tampereen yliopiston kirjasto   Tampereen yliopisto