FM Satu Kärkkäisen molekyylilääketieteen alaan kuuluva väitöskirja

SH2 and SH3 domain interactions and characterization of a novel protein POSH2 (SH2- ja SH3-domeenivuorovaikutukset ja POSH2-proteiinin karakterisointi)

tarkastetaan 22.11.2013 klo 12 Tampereen yliopiston Paavo Koli -salissa Pinni A rakennuksessa, Kanslerinrinne 1, Tampere.

Vastaväittäjänä on professori Jari Ylänne (Jyväskylän yliopisto). Kustoksena toimii professori Hans Spelbrink.

SH2- ja SH3-domeenivuorovaikutukset ja POSH2-proteiinin karakterisointi

Domeenit ovat valkuaisaineiden eli proteiinien itsenäisiä yksiköitä, joilla on tietty rakenne ja toiminta. Domeenit säätelevät soluissa monia proteiinien välisiä vuorovaikutuksia, jotka ovat tärkeitä solunsisäisessä viestinvälityksessä. Toiminnallisen viestivälityskoneistonsa avulla solu pystyy erilaistumaan, kasvamaan ja tarvittaessa myös kuolemaan. Ensimmäiset löydetyt domeenit kuuluivat Src homology-2 (SH2) ja SH3-domeeniperheisiin. Nämä molemmat domeenit ovat kehitysbiologisesti hyvin säilyneitä ja yleisiä solun proteiineissa. SH2-domeeni on noin 100 aminohappoa käsittävä yksikkö, joka sitoo kohdeproteiinissa fosforyloitunutta tyrosiiniaminohappoa ja sitä ympäröivää aluetta. Tyrosiinikinaasit, jotka vastaavat tyrosiiniaminohappojen fosforyloimisesta, luovat toiminnallaan sitoutumispaikkoja SH2-domeeneille. SH3-domeenit ovat puolestaan noin 60 aminohappoa käsittäviä domeeneja, jotka välittävät proteiinivuorovaikutuksia sitoutumalla kohdeproteiinissa olevaan proliinirikkaaseen alueeseen. SH3-domeenin sitoutuminen kohdeproteiiniin on yleisesti ottaen ajateltu olevan heikkoa voimakkuudeltaan (affiniteetti) ja spesifisyydeltään.
 
Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia SH2- ja SH3-domeenien vuorovaikutuksia kohdeproteiineihin. Ensimmäisenä pääkohtana väitöskirjatyössä oli tutkia SH2-domeenien kykyä sitoa tyrosiinifosforyloituja ligandeja sekä solunäytteitä käyttämällä far Western- ja Rosette-menetelmiä. Tulokset vahvistivat SH2-domeenien olevan keskeisiä fosfotyrosiinia sitovia domeeneja ja SH2-domeenien havaittiin tunnistavan spesifisesti tiettyjä solun proteiineja. Tutkimuksessa käytettyjen menetelmien avulla voitiin saada sekä kvantitatiivista että kvalitatiivista tietoa SH2-domeenien sitoutumisesta.

Toisena pääkohtana väitöskirjatyössä oli selvittää ihmisgenomissa esiintyvät SH3-domeenit ja identifioida uusia SH3-kohdeproteiineja. Tätä varten kehitettiin SH3-kirjasto, jossa bakteriofaagien pinnalla ilmennettiin SH3-domeeneja. Tällä phage display-menetelmällä pystyttiin seulomaan SH3-domeeneja, jotka sitoutuivat korkealla affiniteetilla käytettyihin kohdeproteiineihin: p21-aktivoituvaan kinaasiin (PAK2), HI-viruksen Nef-proteiiniin ja proteiineja pilkkovaan ADAM15-proteiiniin. Tutkimuksessa kuvattiin uusia, aiemmin tuntemattomia vuorovaikutuksia näiden kolmen kohdeproteiinin ja eri SH3-domeenien välillä. Näistä vuorovaikutuksista esimerkkinä on PAK2:een korkealla affiniteetilla sitoutuva SH3-domeeni, jonka todettiin olevan osa aiemmin kirjallisuudessa kuvaamatonta POSH2-proteiinia. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin myös muita SH3-domeeneja, jotka sitoutuivat kohdeproteiiniin spesifisesti ja korkealla affiniteetilla, mikä antaa viitteitä SH3-domeenien oletettua keskeisemmästä roolista solun signaalinvälityksessä.

Kolmantena pääkohtana oli karakterisoida uusi POSH-proteiiniperheenjäsen, POSH2, ja tutkia tämän proteiinin toiminnallisuutta. POSH2:n todettiin koostuvan neljästä SH3-domeenista, ubikitiini E3-ligaasiaktiivisuuden sisältämästä RING-domeenista sekä aktiivista GTPaasi-proteiinia, Rac1:tä, sitovasta alueesta. Tutkimuksessa selvitettiin tarkemmin POSH2:n rakenteellisten muutosten vaikutusta Rac1:n sitoutumiseen sekä POSH2:n vaikutusta JNK-kinaasiaktivaatioon. Tutkimustulokset vahvistavat POSH2:n yhtäläisyyttä aiemmin tunnettuihin POSH-proteiineihin ja tuloksien avulla voitiin havaita Rac1:n ja POSH2:n välisen vuorovaikutuksen olevan keskeinen JNK-välitteisessä viestinvälityksessä. Tutkimuksessa havaittu POSH2:n monitoimintainen rooli solussa antaa lähtökohdan proteiinin jatkotutkimukselle.

Tulokset antavat uutta tietoa SH2- ja SH3-domeenien vuorovaikutuksista yksittäisiin ligandeihin ja luonteenpiirteistä toimia domeeniperheinä.

                                               ******

Satu Kärkkäinen on syntynyt Juvalla ja hän on suorittanut filosofian maisterin tutkinnon Helsingin yliopistossa.

Kärkkäisen väitöskirja ilmestyy sarjassa Acta Universitatis Tamperensis; 1866, Tampere University Press, Tampere 2013. ISBN 978-951-44-9252-5, ISSN 1455-1616. Väitöskirja ilmestyy myös sähköisenä sarjassa Acta Electronica Universitatis Tamperensis; 1347, Tampere University Press 2013. ISBN 978-951-44-9253-2, ISSN 1456-954X.
http://tampub.uta.fi.

Väitöskirjan tilausosoite: Verkkokirjakauppa Granum, http://granum.uta.fi, tai e-mail: kirjamyynti@juvenes.fi.

Lisätietoja: Satu Kärkkäinen, Satu.Karkkainen@uta.fi